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Influência do sulfeto no crescimento diazotrófico do metanogênio Methanococcus maripaludis e suas implicações na origem da nitrogenase

Jul 18, 2023Jul 18, 2023

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 799 (2023) Citar este artigo

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Os metanógenos habitam ambientes euxínicos (ricos em sulfeto) ou ferruginosos (ricos em ferro) que promovem a precipitação de metais de transição como sulfetos metálicos, como a pirita, reduzindo a disponibilidade de metal ou enxofre. Tais ambientes têm sido comuns ao longo da história da Terra, levantando a questão de como os anaeróbios obtêm esses elementos para a síntese de cofatores enzimáticos. Aqui, mostramos que um metanogênio pode sintetizar metalocofatores de nitrogenase de molibdênio a partir de pirita como fonte de ferro e enxofre, permitindo a fixação de nitrogênio. As células fixadoras de nitrogênio cultivadas em pirita crescem mais rápido e requerem 25 vezes menos molibdênio do que as células cultivadas em condições euxínicas. Os rendimentos de crescimento são 3 a 8 vezes maiores em culturas cultivadas sob condições ferruginosas em relação às condições euxínicas. Dados fisiológicos, transcriptômicos e geoquímicos indicam que essas observações são devidas à limitação do metal promovido pelo sulfeto, em particular o molibdênio. Essas descobertas sugerem que a nitrogenase do molibdênio pode ter se originado em um ambiente ferruginoso que titulou o sulfeto para formar pirita, facilitando a disponibilidade de ferro, enxofre e molibdênio suficientes para a biossíntese do cofator.

O nitrogênio (N) é essencial para a síntese de ácidos nucléicos e aminoácidos e outras biomoléculas essenciais em todas as formas de vida. O maior reservatório de N da Terra é o gás dinitrogênio (N2) na atmosfera; entretanto, não é biodisponível e deve ser fixado em nitrato (NO3-) ou amônia (NH3) antes de sua assimilação. Como tal, a disponibilidade de N fixo limita frequentemente a produtividade dos ecossistemas1. Na Terra primitiva, acredita-se que o N fixo tenha sido fornecido por processos abióticos, como a oxidação do N2 atmosférico baseada em raios ou a redução mineral do N22,3. No entanto, o N fixo destas fontes teria sido mínimo e finito e, em conjunto, pensa-se que estas características limitaram a produtividade do ecossistema durante este período1. Hoje, aproximadamente 50% de todo o N fixado é gerado através do processo biológico de fixação de N2, pelo qual o N2 é reduzido a NH3 pela enzima nitrogenase (diazotrofia) com o N fixo restante gerado em grande parte através do processo industrial Haber-Bosch.

Três formas diferentes de nitrogenase foram descritas até o momento e estas são diferenciadas pelos (hetero)metais que compõem o sítio ativo de cada complexo enzimático5. Isso inclui formas de nitrogenase apenas com molibdênio (Mo), vanádio (V) e ferro (Fe)6,7. A mo-nitrogenase (Nif) é taxonomicamente a forma mais antiga e mais amplamente distribuída de nitrogenase e, no mínimo, consiste nas proteínas estruturais NifHDK e nas proteínas maturase, NifB (E) N10. O metaloaglomerado do sítio ativo de Nif compreende um núcleo de seis átomos de ferro (Fe) e nove átomos de enxofre (S), com Fe coordenando simetricamente um átomo de carbono central; o metaloaglomerado é coberto por átomos de Fe e Mo [7Fe-Mo-9S] (denominado cofator FeMo ). Além do (s) cofator (es) FeMo, o Nif requer o complexo aglomerado P que consiste em oito átomos de Fe e sete átomos de S [8Fe-7S] . Um cofator FeMo está alojado dentro de cada proteína estrutural NifD, enquanto o cluster P é encontrado na interface de cada NifD e NifK, formando em última análise o heterotetrâmero, NifD2K213. A dinitrogenase redutase, NifH, modula a transferência de elétrons dependente de ATP para NifD2K2 e abriga um cluster [4Fe-4S] adicional para cada uma das duas subunidades NifH . Assim, as células que realizam a fixação de N2 via Nif têm uma alta demanda por Fe, S, Mo, ATP e equivalentes redutores.

Análises filogenéticas de uma concatenação de proteínas NifHDK indicam que as primeiras linhagens em evolução de Nif são encontradas em metanógenos hidrogenotróficos . Estas observações são corroboradas por outros dados que indicam que o NifHDK evoluiu a partir de uma série de duplicações de genes que codificam um ancestral do CfbCD8, proteínas que são necessárias para sintetizar o cofator F43018,19. O fato de F430 (e genes que codificam CfbCD) serem encontrados exclusivamente em metanógenos de arqueas (e alcanotróficos de arqueas)20 é mais uma evidência que indica uma origem para Nif entre os ancestrais dessas Archaea. Esses dados foram usados ​​para sugerir uma origem de Nif entre um ancestral dos metanógenos anaeróbicos durante o Paleoproterozóico médio, ~1,8–2,1 bilhões de anos atrás (Ga)6,9,17, embora dados isotópicos de matéria orgânica preservada em folhelhos datassem de > 3 Ga sugerem uma origem ainda mais antiga21,22. Independentemente da data real de sua origem, a nitrogenase é interpretada como uma enzima antiga que se originou em um ambiente anóxico na Terra primitiva. Uma origem anóxica para esta enzima é consistente com a sensibilidade ao oxigênio dos aglomerados metálicos necessários para a função Nif . O Nif diversificou-se então entre os anaeróbios e só mais tarde na sua história evolutiva foi adquirido através da transferência horizontal de genes entre organismos capazes de integrar oxigénio (O2) no seu metabolismo energético ou capazes de produzir O2 no caso das cianobactérias. A produtividade biológica expandida associada à proliferação de cianobactérias e à produção de O2 teria aumentado a demanda por reservatórios abióticos existentes de N24 fixo, o que pode ter sido a pressão seletiva para desenvolver um mecanismo biológico para reduzir o N2 atmosférico e aliviar a limitação de N7,25.

2.4 Ga)26,27. This is due to the circulation of hydrothermal fluids through iron-rich mid-ocean basalts, which led to input of a greater amount of Fe(II) into anoxic ocean basin waters than sulfide (HS-)28. In the absence of oxygen, the excess Fe(II) would have been stable, and free Fe(II) concentrations are estimated to have ranged from 0.05 to 0.5 mM29. However, the proliferation of Cyanobacteria and the production of O2 during the late Archean drove the oxidative weathering of continental sulfide minerals that increased the flux of sulfate into oceans. When combined with increased productivity near ocean margins30,31, this would have stimulated heterotrophic sulfate reduction and HS- production. In turn, this led to stratified coastal oceans that were oxygenated at the surface and were euxinic (anoxic and HS--rich) at depth30,31,32. In contrast, deeper ocean waters and those more distal from continental margins remained ferruginous26, due to lower productivity in the overlying water column, decreased availability of sulfate and subsequent heterotrophic sulfate reduction, and hydrothermal input of Fe26,33,34. HS- has a high affinity for Fe(II), resulting in the formation of low-solubility iron-sulfide minerals, including pyrite (FeS2)35,36,37. As such, in euxinic environments, concentrations of HS- exceed that of Fe(II), resulting in the titration and precipitation of Fe(II) as FeS2. Under these conditions, excess HS- is also available to complex with other thiophilic metals (e.g., Mo, Co, Ni), potentially rendering them less bioavailable33,34,38./p>6 mM inhibits N2 fixation in stream sediments72. While this effect was attributed to the toxicity of HS- in cells responsible for N2 fixation, it is plausible that the added HS- influenced the availability of trace metals (e.g., Fe, Mo) required for N2-fixing cells62,73,74,75. A similar effect of HS- on metal availability in N2-fixing MmS2 cultures may explain the lower cell yields and increased expression of Mod genes observed in Fe(II)/HS--grown cells relative to those grown with FeS2. MoO42- is a thiophilic molecule that readily reacts with HS- to form soluble thiomolybdate (MoO4-nSn2-) species that can ultimately be incorporated in sulfide minerals, such as FeS271,76. Such thiolation reactions would be expected to occur under the sulfidic (2 mM) cultivation conditions typically used to culture methanogens77 and that were utilized herein for the Fe(II)/HS--grown cultures. These euxinic cultivation conditions potentially limited the availability of MoO42- such that it did not meet cellular demands./p>400 nM MoO42- was required for growth with an optimum of 4000 nM42. These values are much higher than those required of other N2-fixing organisms. For example, aerobic, N2-fixing cyanobacteria such as Anabaena variabilis81, as well as anaerobic N2-fixing purple sulfur bacteria (PSB) inhabiting the interface of oxic/euxinic waters and that serves as a modern analog of the productive continental margins of Proterozoic oceans82, can be supported by less than 10 nM MoO42-. Interestingly, maximum N2 fixation for the PSB was maximal above the chemocline where HS- was near zero82. Thus, it seems incongruous that methanogens would require 40-fold more MoO42- than these organisms, despite ancestors of methanogens likely being where Nif originated6,9./p>1000 nM MoO42- was provided (Fig. 4d). Strikingly, cells provided with FeS2 grew well under all Mo concentrations tested, including when 0 µM MoO42- was added (Fig. 4c). After this experiment, abiotic reactors containing media and FeS2 (no MoO42- added) were analyzed by ICP-MS and were determined to have background (contaminant) Mo ranging from 10 to 30 nM despite using ACS-grade chemicals and acid-washed glassware. Thus, Fe(II)/HS--grown N2-fixing cells required >500 nM MoO42- to achieve near-optimal growth rates and yields whereas FeS2-grown N2-fixing cells required <30 nM MoO42-./p>10-fold lower than previously reported for this strain42. Further, MmS2 cells can achieve optimal growth rates and yields at MoO42- concentrations that are at levels ~100-fold lower than previously reported42. Despite similar growth rates for the FeS2 conditions at different MoO42- concentrations, there was a positive trend in the cell yield with increasing MoO42- that indicates higher MoO42- concentrations are still beneficial to these cells (Fig. 4d). These findings are consistent with other studies that have shown N2 fixation at low Mo concentrations with cells grown under non-sulfidic conditions81,82. Notably, the low levels (10-30 nM) of MoO42- shown to support N2 fixation herein are similar to the inferred Mo concentrations of Proterozoic oceans83,84,85). Other studies investigating Mo requirements for other methanogen species fixing N2 found 1 to 10 µM MoO42- to be the optimal concentrations86,87. There is one other example of methanogens fixing N2 at low (<10 nM) MoO42- concentrations; Nishizawa et al. showed that isolates of Methanocaldococcus and Methanothermococcus from a hydrothermal vent could fix N2 with as low as 5 nM or 1 µM MoO42-, respectively59. This indicates that different methanogen species within the same hydrothermal environment (at different temperatures) can have very different Mo requirements. Importantly, these past experiments were all performed in the presence of >1 mM HS-, necessitating a re-evaluation of methanogens’, and other anaerobes’, ability to access MoO42- in the absence of high HS-. These data support the hypothesis that N2 fixation via Nif is more efficient in low HS- conditions where Mo is more bioavailable./p> ~3 × 107 cells per mL by centrifugation in 50 mL centrifuge tubes (Globe Scientific, Mahwah, NJ) for 30 min at 4696 x g at 4 °C. The supernatant was removed using a line and needle under low-vacuum and the cells were resuspended in 8 mL of basal medium and transferred to a 15 mL centrifuge tube (Globe Scientific)./p>

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